Московская область | Ленинградская обл. | Алтайский край | Архангельская область | Воронежская область | Белгородская область | Волгоградская область
IMG_2654_2.jpg IMG_3404_1.jpg IMG_3532_pan2_1.jpg IMG_4175_pan6_1.jpg IMG_9034.jpg P6302700_1.jpg

Вычислительное моделирование полного белка HOXB13 для прогнозирования функционального эффекта SNP и связанной с ним роли при наследственном раке предстательной железы

  1. Поиск функциональных SNP HOXB13 (Набор данных) Ген HOXB13 человека содержал в общей сложности 517...
  2. Функционально разрушающие nsSNP, предсказанные сервером PolyPhen версии 2 (гомология на основе структуры)
  3. Функциональная проверка вредоносных nsSNP на сервере PANTHER
  4. Функциональное воздействие вредоносных nsSNP на сервер PROVEAN
  5. Функциональное влияние вредоносных nsSNP на сервер nsSNPAnalyzer
  6. Функциональное воздействие вредоносных nsSNP на сервер PhD-SNP
  7. Функционально значимые SNP UTR HOXB13, прогнозируемые сервером UTRscan
  8. Функционально значимые 3' -UTR SNP HOXB13, прогнозируемые базой данных PolymiRTS
  9. Моделирование полного белка HOXB13 с использованием MODELLER v9.17 (сравнительное гомологическое моделирование)
  10. Подтверждение модели Ramachandran Plot
  11. Проверка модели с помощью PDBsum
  12. Картирование вариабельной аминокислотной вариации в белке
  13. Мутация белка и минимизация энергии нативного и мутированного белка
  14. Расчет значений RMSD моделируемого белка
  15. Прогнозирование изменения стабильности мутантных белков с помощью I-Mutant Server
  16. Валидация нативной и мутантной модели с использованием Ramachandran Plot

Поиск функциональных SNP HOXB13 (Набор данных)

Ген HOXB13 человека содержал в общей сложности 517 SNP, полученных из базы данных NCBI dbSNP. 37 и были проверены с использованием Ensembl и HGVBase. Среди найденных SNP миссенс, UTR, синонимичные и интронные SNP составили около 123, 158, 57 и 63 ( Рис. 3 ) соответственно. Белок HOXB13 имел функциональный гомеобокс-связывающий домен (216–275 AA), на который приходилось около 4% миссенс-SNP (23 SNP), тогда как остальные 95 миссенс-SNP приходились на область, отличную от гомеобокса. В этом исследовании миссенс-SNP не-гомеобоксной области HOXB13 были подвергнуты последующему анализу для прогнозирования их влияния на структуру, стабильность и функцию белка.

Фигура 3: Статистическое представление распределения SNP в гене HOXB13 .Фигура 3: Статистическое представление распределения SNP в гене HOXB13

Распределение SNP в гене HOXB13 с пониманием миссенс-SNP гомеобокса (HB) и не-гомеобокса (не HB) (информация получена из базы данных dbSNP). Цифры (например, 148, 63, 101) обозначают номер. SNP, как записано в базе данных dbSNP, тогда как% (например, 29%, 20%, 12%) представляет соответствующий процент вариации SNP среди всех SNP.

Функционально вредные nsSNP предсказаны программой SIFT (основанная на последовательностях гомология)

Из 95 nsSNP не-гомеобоксных областей 39 nsSNP были предсказаны как функционально вредные и были помечены как «Влияет на структуру белка» сервером SIFT ( Таблица 1 ). Среди них 18 nsSNP не-гомеобоксной области были отмечены как вредные с индексом толерантности 0,00. Остальные 56 вариантов были предсказаны как «Переносимые» программой SIFT. Детальный анализ влияния nsSNP на всю не гомеобоксную область (1–215 и 276–284 AA) HOXB13 с помощью программы SIFT можно найти в виде Дополнительный Рис. S3 , Статистическое представление результатов приведено в Рис. 4 , Полные результаты прогноза SIFT можно найти как Дополнительная таблица S1 ,

Таблица 1: Список nsSNP, предсказанных SIFT как вредные.Рисунок 4: Статистическое представление вредного / разрушающего nsSNP, предсказанного различными инструментами insilico.Таблица 1: Список nsSNP, предсказанных SIFT как вредные

Процент вредных nsSNP прогнозируется с помощью SIFT, PolyPhen, PANTHER, PROVEAN, nsSNPAnalyzer, PhD-SNP Analyzer. Из 95 HOXB13 SIFT вне гомеобокса nsSNP прогнозировал 41%, PolyPhen прогнозировал 49%, PANTHER прогнозировал 26%, PROVEAN 21%, nsSNPAnalyzer 54% и PhD-SNPAnalyzer 14% от nsSNP могут быть потенциально вредными / вредными.

Функционально разрушающие nsSNP, предсказанные сервером PolyPhen версии 2 (гомология на основе структуры)

Сервер PolyPhen предсказал, что 47 не гомеобоксных областей nsSNP будут функционально вредными для структуры белка. Из этих 47 nsSNP, 34 nsSNP были «вероятно повреждены» с оценкой в ​​диапазоне от 0,845 до 1,00, а оставшиеся 13 nsSNP были «возможно повреждены» с оценкой в ​​диапазоне от 0,537 до 0,851 ( Таблица 2 ). Интересно, что 22 nsSNP, прогнозируемые SIFT как вредоносные, также предположительно будут наносить функциональный ущерб серверу PolyPhen. Таким образом, 22nsSNP, предсказанные SIFT и PolyPhen, имели функциональное значение. Статистическое представление результатов приведено в Рис. 4 , Полные результаты прогноза PolyPhen доступны как Дополнительная таблица S2 ,

Таблица 2: Список nsSNP, предсказанных PolyPhen как вредные.

Функциональная проверка вредоносных nsSNP на сервере PANTHER

Сервер PANTHER предсказал, что 25 не-гомеобоксных областей nsSNP повредят, а оставшиеся nsSNP будут доброкачественными. Интересно, что 19 nsSNP были предсказаны как вредные для SIFT, PolyPhen и PANTHER ( Таблица 3 ). Кроме того, два nsSNP (G153S, L152M), предсказанные PANTHER и PolyPhen, и один nsSNP (H30Q), предсказанные PANTHER и SIFT, были признаны общими. Графическое представление результатов приведено в Рис. 4 , Полные результаты предсказания PANTHER доступны как Дополнительная таблица S3 ,

Таблица 3: Список nsSNP, предсказанных PANTHER как вредные.

Функциональное воздействие вредоносных nsSNP на сервер PROVEAN

Сервер PROVEAN предсказал, что 20 не-гомеобоксных областей nsSNP будут функционально повреждены из 95 nsSNP, представленных для анализа ( Таблица 4 ). Среди них было обнаружено, что 16 nsSNP являются общими, как и предсказывали серверы SIFT, PolyPhen и PANTHER. Было обнаружено, что один nsSNP (D167N) является общим для обоих, предсказанных SIFT и PolyPhen. Было обнаружено, что два nsSNP (G117E и G117R) имеют общие черты с nsSNP, предсказанными программой SIFT. Графическое представление результатов даны Рис. 4 , Полные результаты прогноза PROVEAN доступны как Дополнительная таблица S4 ,

Таблица 4: Список nsSNP, предсказанных PROVEAN как вредные.

Функциональное влияние вредоносных nsSNP на сервер nsSNPAnalyzer

Из 95 nsSNP, представленных для анализа, было предсказано, что 51 nsSNP связаны с заболевшим фенотипом. Среди них 20 nsSNP были общими для тех, которые были предсказаны вышеупомянутыми четырьмя серверами (SIFT, PolyPhen, PANTHER и PROVEAN) ( Таблица 5 ). Графическое представление результатов приведено в Рис. 4 , Полные результаты прогноза nsSNPAnalyzer доступны как Дополнительная таблица S5 ,

Таблица 5: Список nsSNP, прогнозируемых nsSNPAnalyzer как вредный.

Функциональное воздействие вредоносных nsSNP на сервер PhD-SNP

Мы использовали метод, основанный на SVM, используя алгоритм информации о последовательности и профиле для анализа 95 nsSNP не-гомеобоксной области гена HOXB13 человека. Сервер предсказал 13 nsSNP ( Таблица 6 ) ( Рис. 4 ) быть функционально связанным с заболеванием, а остальные считались доброкачественными. Среди них десять nsSNP были общими для предсказанных вышеописанными серверами (SIFT, PolyPhen, PANTHER, PROVEAN и nsSNPAnalyzer). Графическое представление результатов даны Рис. 4 , Полные результаты прогнозирования PhD-SNP доступны как Дополнительная таблица S6 ,

Таблица 6: Список nsSNP, прогнозируемых сервером PhD-SNP как вредоносный.

Среди 95 nsSNP, не являющихся гомеобоксной областью HOXB13, подвергнутых анализу с помощью серверов SIFT, PolyPhen, PANTHER, PROVEAN, nsSNPAnalyzer и PhD-SNP, 21 nsSNP были функционально значимыми и вызывали повреждающие эффекты для структуры белка HOXB13 , стабильности и функции серверами, упомянутыми выше. Список этих 21 nsSNP приведен ниже: rs761914407 (R215C), rs779330626 (Q188R), rs570681642 (Q181R), rs777986934 (G177V), rs587780164 (D167N), rs766929278, rs (137) (87) (87) (87) (87) (137) (87) (87) (87) (87) (87) (87) (87) (53) rs769634543 (G135E), rs775273363 (A128V), rs201428095 (R123H), rs8556 (S122R), rs138213197 (G84E), rs772962401 (Y80C), rs778843798 (C66R), 86116 (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666) (666), 699 (666), (666) (666), (666), (666), (666), (666), (666), (666) (666), (666), (666), (666), (666); rs770620686 (P59L), rs561048036 (H30Q), rs587780165 (R25Q). Для последующего анализа эти 21 нсСНП были приняты во внимание. Структура белка HOXB13 была доступна только для гомеобокс-связывающего домена (216–275 AA) полного белка, и поскольку не было полной структуры HOXB13 в PDB, был применен подход моделирования гомологии для моделирования полной структуры белка HOXB13 в silico , чтобы мы могли отобразить 21 скрининг вышеупомянутых nsSP в структуру белка и предсказать их влияние на функцию белка, стабильность и биологическую активность.

Функционально значимые SNP UTR HOXB13, прогнозируемые сервером UTRscan

Сообщалось, что мутации в нетранслируемой области гена очень часто связаны с наследственными заболеваниями, такими как рак и различные синдромы иммунодефицита, а также играют ключевую роль в локализации мРНК, стабильности и эффективности трансляции. 45 , И 5'UTR, и 3'UTR выполняют важные функции, касающиеся стабильности и экспрессии зрелой мРНК. Мутации в этих регионах связаны с серьезным влиянием на паттерны экспрессии гена на уровне процессинга и трансляции мНК 46 , Полиморфизмы в 5'-UTR все больше связаны с измененными паттернами рибосомальной способности связывания, стабильности и трансляционной регуляции мРНК, что влияет на период полураспада РНК. Принимая во внимание, что полиморфизмы, соответствующие 3'-UTR, активно участвуют в измененных паттернах полиаденилирования, локализации, стабильности, трансляционной эффективности и специфичности связывания микроРНК (miRNA), тем самым оказывая огромное влияние на паттерны экспрессии генов.

Сервер UTRscan прогнозирует как SNP 5'UTR, так и 3'UTR. Из 101 действующего 3'UTR SNP, взятых для оценки, сервер UTRscan предсказал, что три SNP (rs543028086, rs550968159, rs563065128) будут функционально значимыми, чтобы вызвать изменение шаблона ( Таблица 7 ). Однако сервер UTRscan не предсказал каких-либо вредных 5'-SNP UTR.

Таблица 7: Список SNP UTR HOXB13, прогнозируемых как функционально значимые сервером UTRscan.

UNR (вверх по течению от N-ras) представляет собой транскрипционный фактор, содержащий пять доменов холодного шока (CSD), которые связываются с одноцепочечной ДНК и РНК 47 , Он контролирует и играет основную роль в экспрессии транскрипционных и посттранскрипционных генов. UNR является цитоплазматическим белком, который, как известно, функционирует как РНК-шаперон, и, как было установлено, играет ключевую роль в контроле клеточной пролиферации и гибели 48 , 49 , Белок главным образом дестабилизирует мРНК c-fos и помогает в инициации и активации независимой от цапфа трансляции через IRES для различных транскриптов, особенно протоонкогена c-myc, риновируса, полиовируса, киназы PISTLRE клеточного цикла и про- апоптотический фактор (Апаф-1) 50 , 51 , Было предсказано, что SNP rs543028086 приведет к нарушению мотива сайта связывания UNR (UNR_BS) в 3'UTR гена HOXB13 человека, что приводит к дерегуляции проапоптотического фактора (Apaf-1), который может иметь отрицательный влияние на контроль гибели клеток.

GY-Box является консервативным мотивом, присутствующим в генах-мишенях пути Notch у дрозофилы 52 , Он высококонсервативен в 3'-областях UTR, которые имеют комплементарность последовательностей с 5'-областями области семян miRNA. Результатом является образование дуплексов РНК в результате взаимодействия 3'-конца мРНК и 5'-конца miRNA, что приводит к репрессии трансляции 52 , SNP rs550968159 присутствует в этой области 3'UTR гена HOXB13 человека и ведет к потере специфического паттерна GY-Box, следовательно, исключает вероятность трансляционной репрессии HOXB13, опосредованной GY-Box в 3'UT область, край. Таким образом, было предсказано, что дисбаланс в регуляции обратной связи экспрессии HOXB13 приводит к болезненному состоянию.

Связывающий элемент Mushashi (MBE) представляет собой мРНК-связывающий белок, который играет очень важную роль в регуляции процесса обновления стволовых клеток. 53 , 54 подавляя трансляцию всей мРНК, кодирующей белки, участвующие в ингибировании прогрессирования клеточного цикла 55 , 56 , 3 'UTR SNP rs563065128 приводит к потере мотива UTR MBE в гене HOXB13 человека и, таким образом, было обнаружено, что он теряет свою естественную роль в регуляции процесса обновления стволовых клеток путем подавления экспрессии ингибиторов прогрессирования клеточного цикла, что, как ожидается, приведет к в потере ниши стволовых клеток. Потеря ниши стволовых клеток, в свою очередь, приводит к недоступности локального источника стволовых клеток для пополнения поврежденных клеток ткани, что приводит к болезненному состоянию.

Эти три 3'UTR SNP, как было предсказано, имеют важные вредные эффекты и функциональное значение для экспрессии человеческого гена HOXB13 .

Функционально значимые 3' -UTR SNP HOXB13, прогнозируемые базой данных PolymiRTS

Из 95 рассматриваемых nsSNP только 23 nsSNP сыграли решающую роль в 3'TR области (см. Дополнительная таблица S7 ). Среди них было обнаружено, что пять nsSNP (rs8064432, rs79812861, rs148791210, rs184053751 и rs183620920) разрушают только консервативные (наследственный аллель с поддержкой> = 2) сайты miRNA. Два nsSNP (rs116931900 и rs1056656) были найдены исключительно для создания нового сайта miRNA. Принимая во внимание, что оставшиеся 16 nsSNP, как было предсказано, были вовлечены в разрушение и создание нового сайта miRNA, из которых было обнаружено, что rs61123825 (разрушение - 2 и создание - 7) и rs192244427 (разрушение - 4 и создание 5) имеют максимум 9 изменений рисунка.

Моделирование полного белка HOXB13 с использованием MODELLER v9.17 (сравнительное гомологическое моделирование)

PDB содержит только трехмерную структуру гомеобокс-связывающего домена белка HOXB13 человека, а не полную трехмерную структуру. Для дальнейшего анализа влияния указанных выше коротких списков SNP, не относящихся к гомеобоксной области 21, на структуру и функцию белка HOXB13 , полная структура белка была обязательной, поскольку дальнейший анализ этих требований nsSNP отображал nsSNP в структуру белка и тем самым проверял правильность структуры белка. их последующее влияние на структурные и функциональные аспекты белка in silico . Таким образом, полная структура белка HOXB13 была смоделирована с помощью метода, называемого сравнительным моделированием гомологии, с использованием инструмента MODELLER v9.17 из лаборатории Андрея Сали. Полная процедура моделирования и выполненные шаги были упомянуты в Дополнительный материал ,

Подходящая структура шаблона для разработки модели была получена с использованием psiBLAST путем установки PDB в качестве исходной базы данных. 57 для поиска шаблонов 3D структуры. Полученные последовательности с схожестью и идентичностью по меньшей мере> 30% были отобраны для сравнительного моделирования гомологии. Дополнительная таблица S8 показывает результаты psiBLAST. Было установлено, что PDB ID 2CRA имеет 100% -ную идентичность с последовательностью запроса, а PDB ID 2LD5 и 2L7Z показали 78% -ную идентичность с последовательностью запроса и были выбраны в качестве шаблона для моделирования белка HOXB13 . Соответствующие файлы «.pdb» вышеупомянутых белков были загружены и сохранены в той же папке, где находились файлы сценариев Python. Эти три структуры ID PDB - 2CRA, 2LD5 и 2L7Z были использованы в качестве матрицы для моделирования полного белка HOXB13 с использованием сравнительного моделирования гомологии с помощью MODELLER v9.17. Дерево расстояний последовательности запросов и структуры белка из PDB, вычисленные с помощью psiBLAST, доступны как Дополнительный Рис. S4 ,

Исходя из результатов, мы обнаружили, что 2LD5 и 2L7Z были структурно и последовательно идентичны с тем же кристаллографическим разрешением 1,0 Å (как Дополнительный Рис. S5 ). И наоборот, было обнаружено, что структура 2CRA диверсифицирована как по 2LD5, так и по 2L7Z с показателем дистанции 63,5. Следовательно, структура 2L7Z была окончательно выбрана для моделирования полного HOXB13 из-за его высокой последовательности и структурного сходства с последовательностью запроса. Выполнено выравнивание последовательности запросов (NP_006352) со структурой шаблона 2L7Z ( Дополнительный Рис. S6 ). MODELLER v9.17 было поручено сгенерировать 30 аналогичных моделей полного белка HOXB13 на основе матричной структуры 2L7Z и файла «hox13-2l7z.ali» ( Дополнительный рис. S7 ). Есть несколько критериев для выбора лучшей модели среди различных моделей, сгенерированных MODELLER v9.17. Наиболее важные и широко применяемые критерии включают в себя выбор модели с самым низким показателем DOPE. 58 и самый высокий балл GA341 59 , Соответственно из резюме сгенерированных моделей ( Дополнительный рис. S7 ., мы обнаружили, что 26-я модель «hoxb13.B99990026.pdb» имела самый низкий показатель DOPE -10661,23047 и самый высокий показатель GA341, равный 1,00000. Таким образом, выбранная модель «hoxb13.B99990026.pdb» была подвергнута дальнейшей проверке структуры белка и свойств сворачивания с помощью Ramachandran Plot и PDBsum.

Подтверждение модели Ramachandran Plot

Выбранная модель белка HOXB13 «hoxb13.B99990026.pdb» была подтверждена и аутентифицирована как модель, созданная наилучшим образом, и была подвергнута анализу для двугранных углов (phi и psi) основной цепи аминокислотных остатков в структуре белка 44 , Для хорошей структуры белка ожидается, что в ядре или в предпочтительной области белка должно быть более 90% остатков. 36 , 43 , Сгенерированная модель «hoxb13.B99990026.pdb» была проанализирована с помощью RAMPAGE и обнаружила, что она имеет 250 остатков (88,7%) в предпочтительном регионе, 18 остатков (6,4%) в разрешенном регионе и 14 остатков (5,0%) в выбросе. регион соответственно ( Рис. 5 .) Модель была признана хорошей и надежной, поскольку примерно 89% остатков попало в предпочтительный регион, а также из-за низкого DOPE и высокого показателя GA341.

Рисунок 5: График Рамачандрана для модели сгенерированного белка «hoxb13.B99990026.pdb».Рисунок 5: График Рамачандрана для модели сгенерированного белка «hoxb13

Почти 89% аминокислотных остатков в смоделированном белке «hoxb13.B99990026.pdb» занимали предпочтительную область, 6% остатков занимали разрешенную область, а оставшиеся 5% остатков занимали выделенную область соответственно.

Проверка модели с помощью PDBsum

Имитированная модель белка HOXB13 была дополнительно подтверждена с помощью PDBsum для получения информации о мотивах, спиралях, нитях, доменах, туннелях, углах, позициях, ошибках и т. Д., Присутствующих в трехмерной структуре белков. 60 , «Hoxb13.B99990026.pdb» был подвергнут анализу с помощью PDBsum, и было обнаружено, что он имеет три альфа-спирали, три спирально-спиральных взаимодействия, 18 бета и 40 гамма-витков соответственно ( Рис. 6 ). Результаты соответствовали признакам гомеобоксного домена белка HOXB13 (2CRA). Полная трехмерная структура белка приведена в Рис. 6 (а) , Полный белок HOXB13 , который был смоделирован с использованием MODELLER v9.17, содержал те же особенности и схемы свертывания гомеобоксного домена белка HOXB13 (2CRA), что было ясно видно из Рис. 6 (а, б) , Подробные особенности структуры белка 3D можно найти как Дополнительный рис. S8 ,

Рисунок 6: Результаты валидации белка, смоделированного hoxb13.B99990026.pdb, с помощью PDBsum.Рисунок 6: Результаты валидации белка, смоделированного hoxb13

( a ) Трехмерная структура белка полного белка HOXB13 (hoxb13.B99990026.pdb), смоделированная с использованием MODELLER v9.17 (рисунок, созданный с использованием SWISSPDBViewer). ( б ) HOXB13 (2CRA) 3D-структура белка (рисунок, полученный с использованием PDBsum). ( c ) Аминокислотные остатки, вносящие вклад во вторичную структуру (альфа-спираль и бета-витки) полного белка HOXB13 , изображены на диаграмме топологии (рисунок смоделирован с использованием PDBsum). ( d ) Линейный вид смоделированной полной структуры белка HOXB13 с альфа-спиралями, бета- и гамма-поворотом и соответствующими аминокислотными остатками (рисунок смоделирован с использованием PDBsum).

Таким образом, модель белка «hoxb13.B99990026.pdb», сгенерированная MODELLER v9.17, была признана лучшей моделью, основанной на оценках DOPE и GA341, и была дополнительно подтверждена как хорошая с помощью анализа Ramachandra Plot и PDBsum. Следовательно, эта модель была взята за полную структуру белка HOXB13 человека для дальнейшего анализа соответствующих вредных nsSNP. Модель «hoxb13.B99990026.pdb» была обозначена как структура белка «HOXB13_M26» в последующем анализе.

Картирование вариабельной аминокислотной вариации в белке

Белковый шаблон для проведения мутации и последующего анализа

Структура белка HOXB13_M26 была взята за полную структуру нативного белка для картирования ранее предсказанных 21 вредных nsSNP, а также для дальнейшего изучения их влияния на белок.

Мутация белка и минимизация энергии нативного и мутированного белка

21 nsSNP, проверенный на потенциальную вредоносность различными серверами, был сопоставлен с белком HOXB13_M26 с использованием инструмента «мутации» в SwissPDBViewer. 40 , 61 , Полученные в результате 21 мутированные белки были обозначены как мутант «HOXB13_M26».

Чтобы имитировать условия сворачивания in vivo и параметры белка, минимизация энергии как нативного (HOXB13_M26), так и всех мутантных белков (HOXB13_M26 Mutant) была выполнена с помощью NomadRef Gromacs Server с использованием полей силы конъюгата градиента 42 , Полученные значения энергии всех нативных и мутантных структур приведены в Таблица 8 ,

Таблица 8: RMSD, минимизация энергии, оценка стабильности, качества и структуры белка HOXB13_M26 нативных и мутантных белковых структур.

Общая энергия структуры нативного белка HOXB13_M26 была определена как -4505,484 кДж / моль. Было обнаружено, что среди всех 21 мутанта мутанты C66R и S122R имеют самую высокую энергию -4763,567 кДж / моль и -4745,173 кДж / моль соответственно даже после минимизации энергии по сравнению с нативной структурой. Мутанты D167N (-477,684 кДж / моль), H30Q (-4675,440 кДж / моль), C63G (-4663,925 кДж / моль), Q181R (-4601,128 кДж / моль), C63Y (-596,328 кДж / моль) и Q188R (- Было обнаружено, что 4588.476 кДж / моль) имели значительно более высокие значения энергии, тогда как мутанты R215C, R123H и Q138H показали очень малые значения энергии -4273.583 кДж / моль, -4274.708 кДж / моль, -4376.856 кДж / моль соответственно после энергии сведение к минимуму. Эти nsSNP с очень высокими и низкими энергиями по сравнению со структурой нативного белка подразумевали возможное лежащее в основе повреждающее воздействие на структуру белка, таким образом влияя на стабильность и функцию белка. Было обнаружено, что другие nsSNP имеют примерно одинаковые значения энергии по сравнению с нативной структурой. Карты плотности электронного облака вариантов C66R и S122, которые имели наибольшую энергию, приведены в Рис. 7 (а) ,

Фигура 7: Расчет плотности электронного облака и значения RMSD для мутантных белков.Фигура 7: Расчет плотности электронного облака и значения RMSD для мутантных белков

( а ) Фигура, изображающая разницу плотности электронного облака между структурой нативного белка и мутантами C66R и S122R. Изображения были смоделированы с использованием SwissPDBViewer. ( б ) Наложенные структуры нативного (HOXB13_M26) и мутантного белка C63Y (1,80 Å), C66R (1,68 Å), D167N (1,69 Å), G177V (1,56 Å), H30Q (2,02 Å), P59L (1,80 Å), R25Q ( 1,52 Å) и Y80C (1,23 Å). Значения RMSD и изображение были смоделированы с использованием SwissPDBViewer.

Расчет значений RMSD моделируемого белка

Из 21 проанализированного мутанта было обнаружено, что вариант H30Q имеет самое высокое значение RMSD 2,02 Å, затем следуют C63Y и P59L, имеющие 1,80 Å каждый, соответственно ( Рис. 7 (б) ). Обнаружено, что мутанты D167N, C66R, G177V, R25Q и Y80C имеют значения RMSD 1,69, 1,68, 1,56, 1,52 и 1,2 Å соответственно ( Таблица 8 ). Было обнаружено, что оставшиеся мутанты имеют значения RMSD менее 1 Å. Было обнаружено, что среди мутантов с высокими значениями RMSD мутанты D167N, C66R, C63Y, P59L и H30Q обладали как повышенными энергиями после минимизации энергии, так и значениями RMSD, что имело критическое значение и было учтено при дальнейшем анализе.

Прогнозирование изменения стабильности мутантных белков с помощью I-Mutant Server

Из 21 представленного nsSNP I-Mutant предсказал увеличение стабильности 4 мутантов, а именно rs769634543 (G135E), rs775273363 (A128V), rs8556 (S122R) и rs138213197 (G84E) ( Таблица 8 ). Остальные nsSNP были предсказаны как связанные с пониженной стабильностью. Также было обнаружено, что четыре варианта, которые, как было предсказано, имеют повышенную стабильность, имеют низкие значения RMSD. Значения RMSD и результаты I-Mutant оказались взаимосвязанными, но подлинность еще не была подтверждена Ramachandran Plot.

Валидация нативной и мутантной модели с использованием Ramachandran Plot

Минимизированные по энергии нативные (HOXB13_M26) и мутантные (HOXB13_M26 Mutant) белковые структуры в формате .pdb были отправлены в RAMPAGE для оценки. Нативный (HOXB13_M26) содержал 217 остатков (77,2%) в благоприятной области, 49 остатков (17,4%) в разрешенной области и 15 остатков (5,3%) в области выброса соответственно ( Рис. 8 ). Интересно, что мутанты G84E, G135E и A128V показали повышенную положительную картину по сравнению с нативным белком. G84E содержал 220 (78,3%), 46 (16,4%) и 15 (5,3%) остатков в предпочтительных, разрешенных и выпадающих регионах, соответственно ( Рис. 8 ). Три остатка из разрешенных областей были сдвинуты в предпочтительную область мутанта G84E и дали лучшую картину, чем нативный белок. Мутант G135E также демонстрирует повышенную и стабильную структуру аминокислотных остатков с пятью остатками, смещающимися из разрешенной области в предпочтительную область с общим количеством 222 (79%), 43 (15,3%) и 16 (5,7%) остатков в предпочтительной области. , разрешенные и выпадающие регионы соответственно ( Рис. 8 ) ( Таблица 8 ). Мутант A128V также показал сходную повышенную стабилизирующую картину, где два остатка из разрешенной области стали смещены в предпочтительную область. Мутант A128V содержал 219 (77,9%), 47 (16,7%) и 15 (5,3%) остатков в трех областях соответственно ( Рис. 8 ). Вариант S122R, который, как было предсказано, обладает повышенной стабильностью I-мутантом, не обнаружил следов повышенной картины на графике Рамачандрана. Это точно напоминало структуру нативного белка. Было обнаружено, что мутанты Y80C, C66R и P59L имеют дестабилизирующую структуру аминокислотных остатков. Y80C имел (220, 45, 16), C66R имел (222, 43, 16), а P59L имел (217, 48, 16) остатки в предпочтительном, разрешенном и выделенном регионах соответственно. Интересно, что мутанты C66R и P59L также имеют более высокие значения энергии и RMSD, тогда как сообщалось, что Y80C имеет более высокое значение RMSD. Было предсказано, что среди всех мутантов мутант R215C имеет наиболее дестабилизирующую и повреждающую комбинацию аминокислотных остатков с 216 (76,9%), 51 (18,1%), 14 (5,0%) остатками в благоприятных, разрешенных и выделенных областях. соответственно. Четыре остатка были перемещены из привилегированного региона в разрешенный регион. Также было обнаружено, что мутант C63G имеет сходную дестабилизирующую и повреждающую структуру с R215C. Остальные мутантные модели показали близкие или приемлемые двугранные углы, которые, по прогнозам, придают белку меньший повреждающий эффект по сравнению с вышеупомянутыми мутантами.

Фигура 8: График Рамачандрана для нативного (HOXB13_M26) и мутантного (HOXB13_M26 мутанта) белка.Фигура 8: График Рамачандрана для нативного (HOXB13_M26) и мутантного (HOXB13_M26 мутанта) белка

Каждая панель содержит общий график и графики остатков глицина и пролина. Нативный белок (HOXB13_M26) показал 217 (77,2%), 49 (17,4%) и 15 (5,3%) остатков в благоприятной, разрешенной и выделенной областях, соответственно ( a - c ) Ramachandran Plot для мутантов G84E (220, 46 (15 остатков), G135E (222, 43, 16 остатков), A128V (219, 47, 1 остаток) соответственно, показали повышенную и стабильную картину аминокислотных остатков по сравнению с нативной структурой. ( d ) Мутант S122R (217, 49, 15 остатков) показал тот же характер, что и у нативной структуры. ( e - h ) Мутанты R215C (216, 51, 14 остатков), Y80C (220, 45, 16 остатков), C66R (222, 43, 16 остатков) и P59L (217, 48, 16 остатков) показали высокую дестабилизацию и характер повреждения аминокислотного остатка соответственно.

Достопримечательности России (карты, описания, фотографии), dnt-chukotka.ru
Copyright © 2014. All Rights Reserved.